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1．人中性粒细胞的细胞内pH测定

1）. 试剂

·中性粒细胞 （从人血液中提取）

·HEPES缓冲液

（153 mmol/l NaCl, 5 mmol/l KCl, 5 mmol/l 葡萄糖, 20 mmol/l HEPES, pH 7.4）

·BCECF-AM special packaging

·标定用缓冲液

（130 mmol/l KCl, 10 mmol/l NaCl, 1 mmol/l MgSO₄, 10 mmol/l Na-MOPS）

·Nigericin

2）. 染色及测定方法

a. 用HEPES制备细胞悬液，细胞浓度为4×10e7个/ml。

b. 加入1 mmol/l的BCECF-AM溶液，终浓度为3 µmol/l，在37℃下孵育30分钟。

c. 用HEPES缓冲液充分清洗细胞外的BCECF-AM和凝集的中性粒细胞。

d. 用缓冲液将BCECF染色的细胞制成3×10e7个/ml的细胞悬液。

e. 取适量的细胞悬液，细胞数量为3×10e6个/ml，用荧光光度计测定荧光 （激发波长500 nm，发射波长530 nm）。

f. 在37℃下孵育10分钟后，添加刺激药物，记录荧光强度的变化。

3）.标准曲线

a. 准确配制标定用缓冲液 （例如pH值：6.6、7.0、7.2、7.4、7.8、8.2 ）。

b. 从细胞悬液中取3×10e6个/ml细胞，离心清洗后用1 ml标定缓冲液混合，制成细胞悬液。

c. 加入nigericin终浓度为10 µg/ml，孵育约10分钟后，测定荧光强度。

d. 横轴为缓冲液的pH值，纵轴为荧光强度作图。

2．注意事项

a. 若BCECF很难转入细胞，可以同Fura 2一样，用Pluronic F-127等表面活性剂。

b. 对于两个激发波长，详见参考文献1）和5）。

c. 请先将nigericin用乙醇配制成2 mg/ml的储备液。

对于细胞凋亡荧光染料Hoechst 33342 /PI 双染 （2010-8-5）

对于Hoechst 33342

一、原理

正常情况下，荧光染料 Hoechst 33342 只有少量能透过细胞膜进入细胞，使其染上低蓝色。但是当细胞发生凋亡时，它的细胞膜通透性增强，因此进入凋亡细胞中的Hoechst 33342 比正常细胞的多，荧光强度要比正常细胞中要高。此外，凋亡细胞的染色体DNA 的结构发生了改变，从而使该染料能更有效地与DNA 结合，并且凋亡细胞膜上的p-糖蛋白泵功能受到损伤不能有效地将Hoechst 33342 排出到细胞外使之在细胞内积累增加等都使凋亡细胞的蓝色荧光增强。

二、激发波长和仪器

使用带有350nm激发波长和460nm发射波长的滤光片的荧光显微镜观察细胞。

叁、毒性

Hoechst 33342对人体有害，请注意适当防护，操作时要十分小心，注意穿实验服并戴一次性手套。

四、操作

1．对于固定的细胞或组织：
（1）对于细胞或组织样品，固定后，适当洗涤去除固定剂。随后如果需要进行免疫荧光染色，则先进行免疫荧光染色，染色完毕后再按后续步骤进行Hoechst 33342染色。如果不需要进行其它染色，则直接进行后续的Hoechst 33342染色。
（2）对于贴壁细胞或组织切片，加入少量Hoechst 33342染色液，覆盖住样品即可。对于悬浮细胞，至少加入待测染色样品体积3倍的染色液，混匀。室温放置3-5分钟。
（3）吸除Hoechst 33342染色液，用TBST、PBS或生理盐水洗涤2-3次，每次3-5分钟。
（4）直接在荧光显微镜下观察或封片后荧光显微镜下观察。细胞发生凋亡时，会看到凋亡细胞的细胞核呈致密浓染，或呈碎块状致密浓染。
2。对于活细胞或组织：
（1） 加入适当量Hoechst 33342染色液，必须充分覆盖住待染色的样品，通常对于六孔板一个孔需加入1ml染色液，对于96孔板一个孔需加入100微升染色液。
（2）在适宜于细胞培养的温度培养10-20分钟。弃染色液，用PBS或培养液洗涤2-3次即可进行荧光检测。

五、注意事项

（1）Hoechst 33342染色后的荧光会有淬灭现象，所以建议染色后在当天完成检测，放置时间不宜过长。

（2）一般情况下，Hoechst 33342染料的浓度推荐为10-50μM。

六、同仁化学Hoechst 33342的优点

（1）配制好的容液，减少操作步骤，减小对人体危害。该产物相对DAPI致癌性更小一下。

（2）可以和PI一起用于细胞凋亡检测，染色后可看出细胞凋亡情况：正常细胞为低蓝色/低红色（Hoechst 33342+/PI+），凋亡细胞为高蓝色/低红色（Hoechst33342++/PI+），坏死细胞为低蓝色/高红色（Hoechst 33342+/PI++）。

（3）对于活细胞，33342比33258穿透膜的能力更强一些。

（4）小包装适用于老师做量小的实验，不会造成试剂浪费。